name of GOD

بسم الله الرحمن الرحیم

آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی 2

استاد

سرکار خانم منصف

عنوان آزمایش

آشنایی با دستگاه اسپکتروفتومتر و رسم طیف جذبی

اعضای گروه

مقدمه

اسپکتروفتومتر یا طیف سنج، دستگاهی است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. این کار با انکسار پرتو نور به طیف طول موج ها و آشکارسازی شدت ها با دستگاه باردار و نمایش نتایج به صورت گراف انجام می شود. در حقیقت این روش با استفاده از میزان جذب نور، تعیین غلظت می کند. این روش قابلیت اندازه گیری نمونه های فوق العاده کوچک را دارد .

نور از بسته های بسیار کوچکی به نام فوتون تشکیل شده است که انرژی هر یک از آنها به محض برخورد به یک الکترون منتقل می شود. تنها هنگامی انتقال رخ می دهد که انرژی فوتون ها برابر با انرژی مورد نیاز برای انتقال الکترون به لایه انرژی بعدی باشد . به طور کلی نور با طول موج و انرژی خاص به نمونه تابانده شده و مقدار مشخصی از انرژی آن جذب می شود. سپس با اندازه گیری انرژی رد شده از نمونه توسط یک فوتودتکتور، مقدار جذب تعیین می شود. اسپکتروفتومتر دستگاه پیچیده ای است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. در این دستگاه نور توسط یک منبع نور تولید شده و پس از گذشتن از میان نمونه مورد نظر نور، به صورت طیفی منتشر می شود سپس به وسیله سنسور ها آشکارسازی شده و به صورت نتایج قابل کاربردی ترجمه می شود. خروجی اسپکتروفتومتر همیشه نموداری از شدت نور نسبت به طول موج است. داده هایی که برای تولید نمودار گردآوری شده، در جدولی از شدت نور و طول موج ذخیره می شود. مقدار گراف بیان کننده مقدار عبور یا مقدار جذب است. اسپکتروفتومتر های امروزی دیجیتالی بوده و به وسیله میکروپروسسور کنترل می شوند.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ

اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است. اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع نور، عدسی، شکافها، منوکروماتور (صافی، منشور یا ((Grating system) می باشد. بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد.

1- منبع نورانی:منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر بسته به ناحیه مورد استفاده، متفاوت می باشد. برای نورهای مرئی از لامپ تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین 350 تا 800 نانومتر ایجاد می کند. و برای نورهای ماوراء بنفش (UV) از لامپ جیوه، هیدروژن استفاده می شود. این لامپها در ناحیه بین 200 تا 600 نانومتر بکار می روند. در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع لامپ وجود دارد.

2- عدسی ها: (آینه ها): برای کنترل کردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است. به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود.

3- شکافها (slits): در هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود دارد: یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند. شکافها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج مشخص دارند. به همین جهت اندازه این شکافها بسیار مهم هستند. بیشتر دستگاهها پیچی دارند که اندازه این شکافها را می توان برحسب احتیاج تغییر داد. هر چه طول این شکافها بیشتر باشد پهنای نور عبوری (band-pass) بیشتر بوده و دامنه طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند. این نور اضافی را Stray light می نامند

4- منوکروماتور(monochromators): اشعه نورانی پس از عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آنها کنترل شده سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم تبدیل کند وارد می شود. پس نوری با طول موج مشخص و انتخابی به وجود می آورند. دو نوع منوکروماتور وجود دارد منشور و Grating.

5- محل نمونه:ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت (cuvett) می نامند که از جنس شیشه، کوارتز یا پلاستیک است. برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بلانک بکار می رود. سلهای شیشه ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی به کار می رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود. طول سلها معمولا 1 سانتی متر است و سلهایی با طول cm 1/0 تا cm 10 نیز موجود می باشد. محل قرار گرفتن نمونه بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بلانک) دارد یا نه، Single beam و Double beam نام دارد. و کووت ها برحسب نوع شیشه و شکل چند نوع می باشند.

1- کووتهای مکعبی: سطح مقطع این کووت ها مربع بوده و از جنس شیشه خالص (برای نورهای مرئی) و کوارتز( برای نور ماوراء بنفش) می باشند. شیشه نور مرئی را از خود عبور می دهد ولی نور ماوراء بنفش را به مقدار زیادی جذب می کند. کووتهای مکعب، گران و کارکردن و تمیز نگهداشتن آنها دقت بسیار لازم دارد.

2- کووتهای گرد: سطح مقطع این دسته از کووتها گرد بوده و برای کارهای روزمره آزمایشگاهی بکار می روند. با همه دقتی که در ساختن کووتها می شود ،مکرر دیده می شود که آیا A دو کووت مشابه، یکسان نیست. برای جلوگیری از استفاده کووتهای ناجور باید آنها را کالیبره نمود.

برای کالیبره کردن کووتها محلولی را که نسبتا پایدار است مثل هموگلوبین با غلظت 50 میلی گرم درصد میلی لیتر تهیه می نمایند. باید T این محلول در طول موج nm 540 برابر 3/0 ± 50% باشد. راه دیگراینست که به جای کالیبره کردن کووتها از یک کووت برای شاهد و استانداردو نمونه استفاده کنند.

6- دتکتور (نور سنج): نور پس از عبور از عدسیها و شکافها و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می رود. اسباب منوکروماتور، نور دلخواه و با طول موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند. رنگ این نور مکمل رنگ محلول است. اگر رنگ محلول سبز- آبی (مثل تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج nm  495-475 باشد رنگ فیلتر- منشور یا گریتینگ باید نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین nm 620-600 باشد. چون رنگهای نارنجی مکملش سبز-آبی است. بنابراین وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ،جذب شده و بقیه آن به نورسنج می رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید. دتکتورها شامل انواع فتوشیمیائی، فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پلایر تیوب استفاده می شود.

7- رکوردر (الکتریک سنج)در اسپکتروفتومتر احتیاج به دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه بگیرد. دو سیستم گالوانومتر و نول پوینت وجود دارد که در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند معمولا از یک گالوانومتر یا صفحه دیجیتالی استفاده می شود. دیاگرام زیر، طرح یک اسپکتروفتومتر ساده را نشان می دهد.

اسپکتروفتومتری بر اساس دو قانون استوار است :

قانون بیر:

اگر نور تک رنگی از محلولی جاذب و شفاف عبور کند،میزان نور جذب شده با تعداد مولکول های جسم محلول که در مسیر اشعه نوری قرار دارد متناسب است.

قانون لامبرت:

نسبت انرژی نورانی که توسط مولکول های یک ماده در لایه های مختلف محلول جذب می شود ثابت است،و به شدت نور بستگی ندارد.

هر چه طول مسیر عبور نور بیشتر باشد،جذب نور کمتر است.

میزان نور عبور یافته بر حسب درصد نور ورودی نشان داده می شود.

طرز کار:

۱- پس از اتصال به برق مدتی باید صبر کرد تا دستگاه گرم شود

۲- طول موج ماکزیمم را روی دستگاه تنظیم می نمایند.

۳- در شرایطی که جا سلی دستگاه، خالی است با در باز یا بسته (بستگی

به نوع دستگاه دارد) صفر ترانس میتانس را تنظیم می کنیم.

۴- بلانک آبی و بلانکهای دیگر را در جا لوله ای دستگاه گذاشته آن را روی صددرصد T و یا صفر A تنظیم می کنند.

۵- نمونه ها را در سل ریخته و مقدار جذب آنها را می خوانیم.

۶- سلها حتما باید تمیز بوده و قطرات محلول اطراف آن باید با دستمال کاغذی پاک شود.

مواد و وسایل آزمایش

پهنک برگ اسفناج ( رگبرگ های اصلی جدا شوند و در آزمایش به کار نروند.)

هاون ( برای له کردن برگ اسفناج تا رنگیزه از آن خارج شود. )

استون 80%             ***      کاغذ صافی         ***    لوله آزمایش ***     پوآر

بشر   ***    کووت   ***        دستگاه اسپکتروفتومتر   ***   پیپت  ***   ترازو

روش کار

با استفاده از ترازو 2 گرم از پهنک برگ اسفناج که فاقد رگبرگ اصلی میباشد را وزن کرده و سپس خرد میکنیم.  پهنک حاصله را داخل هاون ریخته و به آن 20 سی سی استون 80% اضافه میکنیم . پهنک اسفناج را در استون فشرده و له میکنیم تا رنگیزه آن خارج شده و عصاره یکنواختی به دست آید . بعد از اینکه عصاره یکنواختی به دست آوردیم آن را از کاغذ صافی عبور میدهیم در این مرحله باید دقت شود که کاغذ صافی فشرده نشود ، چون رنگیزه ها رسوب کرده و از کاغذ صافی عبور می کنند.

حجم نهایی را هم با استون 80% به 15 الی 20 سی سی میرسانیم.

1سی سی از عصاره به دست آمده را با پیپت برداشته و داخل یک لوله آزمایش میریزیم و به آن 5سی سی استون 80% اضافه میکنیم ( لوله آزمایش    c1 )

از لوله c1  ،یک سی سی  از محلول را برداشته و در لوله آزمایش دیگری میریزیم و 5 سی سی استون 80% به آن اضافه می کنیم .  (  لوله آزمایش  c2  )

*** محلول بلانک ما در این آزمایش استون 80% میباشد .

با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر میزان جذب محلول های موجود در دو لوله آزمایش را هر کدام به صورت جداگانه در طول موج های بیان شده در جدول زیر بدست می آوریم.

نتایج

محلول لوله c2 کمرنگ تر و شفاف تر از محلول لوله c1 می باشد .

 نکته : با توجه به داده های دو جدول نمودار آنها را رسم کنید ( طول موج محور افقی و میزان جذب محور عمودی می باشد )

نظرات شما عزیزان:

نام :

آدرس ایمیل:

وب سایت/بلاگ :

متن پیام:

نظر خصوصی

 کد را وارد نمایید:

 

 

 

عکس شما

آپلود عکس دلخواه: